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Esistono due differenti tipologie di tali preparati:
- Preparato a fresco: cioè un preparato che viene allestito per una singola osservazione o al massimo per osservazioni subito successive. Si prepara ponendo il campione su una goccia d'acqua preventivamente posizionata su di un vetrino portaoggetti e ricoperto con un vetrino coprioggetti. La caratteristica principale di un preparato a fresco è che non viene fissato, quindi non può essere conservato per lunghi periodi. Tuttavia i preparati a fresco possono essere colorati. In questo tipo di preparati possono essere osservati microorganismi ancora vivi.
- Preparati Fissati, inclusi e colorati.
Per prevenirne il processo di decomposizione i tessuti destinati all'analisi microscopica vengono trattati tramite un processo chiamato fissazione. La fissazione è necessaria poiché, una volta asportati dall'organismo di appartenenza, i tessuti perdono rapidamente le loro proprietà chimiche e fisiche a causa dei processi di decomposizione dovuti all'assenza di nutrimento e favoriti dall'azione dei microrganismi che immediatamente attaccano e invadono il materiale biologico. Perciò tramite la fissazione si riesce a ritardare o magari impedire questi processi. Per ottenere questo effetto i tessuti appena prelevati vengono trattati con composti chimici quali alcoli e aldeidi fissando le molecole presenti nel tessuto nello stato chimico e nella posizione in cui si trovano in vivo.
2.Disidratazione:
I tessuti biologici, una volta prelevati e fissati, perdono la consistenza necessaria al loro mantenimento impedendo così il taglio in sezioni osservabili al microscopio.
L'inclusione però richiede la penetrazione all'interno della cellula di sostanze apolari ma poiché essa è costituita prevalentemente da acqua (polare) prima di procedere all'inclusione è dunque necessario allontanare la componente acquosa utilizzando dell'alcol in una cosiddetta "scala ascendente degli alcol", che è però anch'esso insolubile in paraffina. Una volta allontanata l'acqua perciò si procede alla rimozione dell'alcol attraverso sostanze come lo xilene, solubile invece in paraffina. Quest'ultimo processo è chiamato diafanizzazione, in quanto il tessuto immerso in xilene diventa completamente trasparente.
3.Inclusione:
Una volta avvenute la disidratazione e la diafanizzazione tali tessuti vengono inseriti(inclusi) in materiali più resistenti, che possano fungere da sostegno. Il mezzo d'inclusione più comune per la microscopia ottica è la paraffina, un composto ceroso di natura lipidica che consente di ottenere delle "fette" di 1-10 micron di spessore. Poiché, però, nella microscopia elettronica lo spessore deve essere dell'ordine degli Angstrom (fette circa 10.000 volte più sottili quindi) si usano delle resine acriliche, fluide a temperatura ambiente e solidificate per mezzo di un agente polimerizzante (calore o raggi UV), le quali consentono maggiore durezza del campione e quindi facilitano il taglio di sezioni estremamente delicate.
4.Taglio in sezioni:
Affinché un tessuto possa essere osservato al microscopio ottico,deve essere sufficientemente sottile da permettere alla luce di attraversarlo. Per ottenere questo risultato, prima dell'esame microscopico i tessuti vengono suddivisi in sezioni sottilissime, tramite uno strumento chiamato microtomo (per sezioni da microscopia ottica) o ultramicrotomo (per sezioni da microscopia elettronica). I moderni microtomi sono in grado di ottenere sezioni di spessore non superiore ai 20-30 µm (1 micrometro = 10^−6 metri) ottenendo sezioni che possono arrivare a contenere uno strato unico di cellule ed evitando perciò che la sovrapposizione di più strati cellulari possa disturbare la visione.
5.Colorazione:
Un altro passaggio fondamentale per permettere lo studio dei tessuti al microscopio è la colorazione. I tessuti animali, infatti, sono nella maggior parte dei casi incolori (perché costituite in gran parte di acqua e prive di pigmenti) e trasparenti, tanto da risultare pressoché invisibili al microscopio ottico. Sono state perciò scoperte o realizzate, fin dalla nascita dell'istologia scientifica, una serie di sostanze coloranti, capaci appunto di colorare le cellule, o le diverse parti di una cellula, in modo da renderle immediatamente visibili e distinguibili. Al giorno d'oggi sono note moltissime sostanze di questo tipo, che possono essere divise in due grandi gruppi in base ai meccanismi con cui si legano ai diversi componenti cellulari:
- i coloranti basici, che si legano alle molecole con caratteristiche acide (come il DNA)
- i coloranti acidi, che si legano alle molecole con caratteristiche basiche (come gran parte delle proteine citoplasmatiche)
Oltre ai coloranti tradizionali, negli ultimi anni hanno preso piede anche le tecniche della immunoistochimica per individuare e distinguere i diversi componenti cellulari: queste tecniche, che risultano molto utili per evidenziare singole classi di molecole all'interno della cellula, prevedono l'uso di anticorpi opportunamente trattati, in grado di legare e visualizzare specifiche proteine, lipidi o carboidrati. In questo caso per l'osservazione si può utilizzare un microscopio a fluorescenza che possa rilevare la fluorescenza emessa dagli anticorpi marcati con sostanze fluorescenti.
Una tecnica alternativa alla fissazione e all'inclusione è il congelamento. Con questo metodo le cellule vengono congelate divenendo al contempo sia resistenti alla decomposizione, sia sufficientemente consistenti per essere analizzate. Questo processo può risultare svantaggioso poiché il congelamento rischia di produrre dei danni strutturali se avviene troppo lentamente. Ciò accade poiché la componente acquosa si organizza in cristalli che possono falsare la struttura originaria del campione. La tecnica più usata per effettuare il congelamento evitando la formazione di cristalli è l'esposizione all'azoto liquido, in grado di portare istantaneamente il campione ad una temperatura di circa -196 °C.
Tra i vantaggi invece è presente il fatto che si tratta di una tecnica di natura fisica e quindi non sono in gioco sostanze chimiche (come i fissativi) che possono reagire modificando il contesto strutturale della cellula. Questa tecnica consente inoltre un accorciamento dei tempi di allestimento di preparati istologici, in quanto evita la procedura di inclusione in paraffina che porta spesso alla perdita di buona parte della componente lipidica del tessuto, a causa dei trattamenti di disidratazione per mezzo di alcoli. Tale accorciamento di tempi viene sfruttato durante le operazioni chirurgiche qualora il chirurgo abbia dei dubbi sulla diagnosi. Il campione da analizzare preventivamente congelato è poi sezionato con un particolare tipo di criostato utilizzato in combinazione con un microtomo.
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